一般化学工业论文_脂肪酶HL1232脱除大豆毛油中(2)

    4.3.8 ~(19)F位点特异性标记实验参数设置及图谱采集

    4.3.9 位点特异性自旋顺磁共振标记实验标记步骤

    4.3.10 位点特异性自旋顺磁共振标记实验参数设置与图谱采集

4.4 实验结果与讨论

    4.4.1 HL1232 各代表性氨基酸突变体的表达纯化及标记

    4.4.2 HL1232 各代表性氨基酸突变体的酶活测定

    4.4.3 HL1232 与磷脂结合前后代表性氨基酸构象的19F位点特异性标记分析

    4.4.4 HL1232 与不同底物结合前后代表性氨基酸的动力学信息分析

    4.4.5 HL1232 与不同底物结合前后代表性氨基酸的易趋性参数分析

4.5 本章小结

第五章 脂肪酶HL1232 底物选择性的分子模拟研究

5.1 引言

5.2 实验方法

    5.2.1 分子对接体系方法的建立

    5.2.2 分子动力学模拟体系方法的建立

5.3 实验结果与讨论

    5.3.1 脂肪酶HL1232和TLL与磷脂底物分子对接结果对比

    5.3.2 脂肪酶HL1232和TLL与甘油三酯底物分子对接结果对比

    5.3.3 脂肪酶HL1232和TLL与甘油二酯底物分子对接结果对比

    5.3.4 脂肪酶HL1232和PCEST、EST1 以及TTEST结构对比分析

    5.3.5 脂肪酶HL1232 与不同底物结合的分子动力学模拟分析

5.4 本章小结

结论与展望

1.主要研究结论

2.主要创新点

3.未来工作展望

参考文献

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

附件

文章摘要:脱除毛油中的磷脂（脱胶）是油脂精炼工艺中的重要工序,良好的脱胶效果是保障油脂得率和品质的必要条件。在众多脱胶工艺中,不断改良的酶法脱胶技术以其高效、环保、底物专一性高等优点应用越来越广泛。酶制剂对磷脂、甘油酯底物的专一性是由其底物识别机制决定的,是酶法脱胶技术的核心理论基础,也是影响油脂脱胶效果的关键因素。国内外研究工作者考察了大量不同种类脂肪酶/磷脂酶在油脂酶法脱胶中的应用研究,但是对引起脱胶效果差异的酶学基础,特别是影响底物选择性的分子识别机制还未进行深入系统的研究。在前期研究基础上,本论文考察了五种脂肪酶在大豆毛油脱胶应用中的效果,筛选出了脱胶效率最佳的脂肪酶,并进一步揭示了其对磷脂、甘油酯等分子的底物识别机制,阐明了酶法脱胶机理。此研究为脂肪酶分子结构精准改造获得油脂脱胶高效专用酶制剂提供了坚实的科学依据。主要研究内容与结果如下:一、不同脂肪酶对大豆毛油脱胶效果的筛选研究成功构建了TLL、HL1232、PCEST、EST1和TTEST五种脂肪酶的基因工程菌,并在大肠杆菌E.coli Shuffle T7 Express中实现了高效表达,利用亲和层析等纯化技术获得了纯酶。表征了五种脂肪酶的最适反应温度及pH（HL1232为55℃,pH 6.0;TLL为50℃,pH 9.0;PCEST为70℃,pH 9.0;EST1为70℃,pH 5.0;TTEST为80℃,pH 8.0）。进一步以大豆毛油为底物考察重组脂肪酶的脱胶效率,在一定的脱胶反应条件下（各酶50℃和最适pH,加水量3%,加酶量为50 mg/kg及反应时间5 h）,脱胶5 h后,HL1232对大豆油毛油脱胶效率为96.18%,脱胶大豆油产物中磷量为6.22 mg/kg。TLL的脱胶率为76.89%,而PCEST、EST1和TTEST的脱胶效率均低于50%。相比之下,HL1232在大豆油中的脱胶效果最佳,因此选取其进行后续脱胶机制研究。二、脂肪酶HL1232的底物分子识别及其脱胶机制研究通过氨基酸序列比对分析得知,HL1232与TLL具有高度的序列相似性（85.25%）。研究比较了HL1232与TLL对甘油三酯及磷脂底物的水解活力的差异。结果表明,与TLL相比,HL1232表现出高磷脂底物水解活力及低甘油三酯底物水解活力（最适的反应条件下,磷脂酶活力为3273.81 U/g;脂肪酶活力4290.75 U/g）。而与HL1232相比,TLL却表现出低磷脂底物水解活力及高甘油三酯底物水解活力（最适的反应条件下,磷脂酶活力为626.36 U/g;脂肪酶活力9825.83 U/g）。利用同源建模获得了HL1232的三维空间结构,并与TLL结构进行对比,发现HL1232除了N-端的突变位点外,其C-末端含有一个额外的由α-螺旋片段（292-317位氨基酸残基）和loop区（263-291位氨基酸残基）组成的肽段。为了验证其功能,设计并构建了HL1232-D_292-317和HL1232-D_263-317这两个C-末端缺失突变体。当只删除C-末端α-螺旋片段时,HL1232-D_292-317的最适磷脂底物水解活力比起HL1232-wt降低了67.55%,而甘油三酯底物水解活力是HL1232-wt的2.02倍。继续删除C-末端loop区时,最适磷脂酶和脂肪酶活力分别只降低了6.34%和5.78%。这表明C-末端α-螺旋片段对脂肪酶HL1232的不同底物分子识别起到了最主要的作用。（1）从结构及构象的角度来阐明C-末端α-螺旋片段作用于HL1232底物选择性机理:首先采用核磁共振技术研究了标记有BTFA探针的各HL1232突变体与磷脂底物结合的构象变化。当磷脂底物存在时,N313所在的C-末端α-螺旋肽段主链发生了明显的构象变化,G245和S214所处的肽段也有一定的摆动,而远离C-末端α-螺旋片段的S224所在的位置没有明显构象变化。这些实验现象证实了C-末端α-螺旋片段参与了磷脂底物的结合与锚定。再次,利用电子自旋顺磁共振仪对标记有MTSSL探针的HL1232各突变体与磷脂底物、甘油二酯或甘油三酯底物的相互作用进行研究。当甘油三酯或磷脂存在时,HL1232突变体K311C（S146A）的τc值从2.44(×10

文章来源：《波谱学杂志》 网址: http://www.bpxzz.cn/qikandaodu/2021/1110/372.html